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ELISA實(shí)驗(yàn)中常見的問題
問題一:哪些樣本可用于ELISA實(shí)驗(yàn)?
答:血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、尿液、唾液、腦脊液等。不同的樣本類型有不同的處理方法。
1、血清:指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白原及某些凝血因子后分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白原已被除去的血漿。血清是 ELISA 實(shí)驗(yàn)常用的樣本，其預(yù)處理也十分簡(jiǎn)單。
使用無熱原無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置 2 小時(shí)或 4℃過夜，分離出血清(建議傾斜試管或離心管以擴(kuò)大液面的橫截面，使血清可以更大程度地分離出來)。4℃下以1000×g 離心 20 分鐘，小心收集上清液(血清)，立即進(jìn)行測(cè)定。建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復(fù)凍融。
在收集血液樣本的過程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞在溶解時(shí)會(huì)釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA 實(shí)驗(yàn)中將會(huì)出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。另外，樣本還應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榧?xì)菌可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。
2. 血漿:是離開血管的全血經(jīng)抗凝處理后，通過離心沉淀，所獲得的不含細(xì)胞成分的液體。血漿與血清的主要區(qū)別在于血漿中含有纖維蛋白。
使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后 30 分鐘內(nèi)，4℃下以 1000×g離心 15 分鐘，小心收集上清液(血漿)。建議在-20℃或-80℃下將收集的血漿分裝保存，避免反復(fù)凍融。樣本應(yīng)避免溶血或高血脂。常見的抗凝劑包括 EDTA(部分酶相關(guān)指標(biāo)不建議使用)，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。檢測(cè)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀 ELISA 試劑盒說明書，查看該試劑盒針對(duì)抗凝劑是否有特殊要求。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:含有細(xì)胞分泌蛋白和死細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液。
將細(xì)胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中并以 1000×g 離心 20 分鐘，除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保存在-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。
4. 細(xì)胞裂解液:經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解后的細(xì)胞溶液。
(1)吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細(xì)胞沖洗干凈。 懸浮細(xì)胞可以省略該步驟。
(2)將細(xì)胞懸浮液收集到離心管中，以 1000×g 離心 10 分鐘，然后吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞 3 次。
(3)加入適量的預(yù)冷 PBS(建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑)重懸細(xì)胞。在 6 孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔 需要 150-250μL 的 PBS 來重懸細(xì)胞。
(4) 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過程數(shù)次，直至細(xì)胞裂解。也可 以使用超聲波細(xì)胞破碎器超聲處理懸浮液來裂解細(xì)胞。
(5) 4℃下以 10,000×g 離心 10 分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液， -20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
5. 組織勻漿
(1) 用預(yù)冷的 PBS(0.01M，PH7.4)沖洗組織以除去表面殘留的血液或雜質(zhì)。
(2) 將組織塊稱重，然后切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿。
(3) 加入適量的預(yù)冷 PBS(體積取決于組織的重量，9 mL PBS 適用于 1 g 組織，建議使用前立即在 PBS 中加入適量蛋白酶抑制劑)，用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。
(4) 將勻漿液吸入離心管中，4℃ 下以 5000×g 離心 5~10 分鐘，收集上清液，保存至-20℃或-80℃， 避免反復(fù)凍融。
一般來說，由于 ELISA 實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)的含量，因此要求樣本應(yīng)清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質(zhì)。為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性， -20℃或-80℃保存的樣本應(yīng)在 1-6個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)，4℃保存的樣本在一周內(nèi)完成檢測(cè)。
問題二:ELISA法一般都能檢測(cè)血清、血漿和細(xì)胞上清嗎?
答:不能。原因主要從指標(biāo)適應(yīng)性和體系適應(yīng)性2個(gè)方面來說明。
首先，我們要根據(jù)既往的研究和文獻(xiàn)報(bào)道確認(rèn)，我們所檢測(cè)的靶標(biāo)是否在血清、血漿中有正常表達(dá)，是否在疾病狀態(tài)，特殊生理時(shí)期，特定的生物鐘時(shí)會(huì)分泌表達(dá)，如果以上幾種情況都不存在，或者暫時(shí)沒有研究結(jié)果支持，那么使用血清或血漿檢測(cè)可能無信號(hào)值。另外，ELISA 方法并不是只能檢測(cè)分泌性靶標(biāo)，某些靶標(biāo)經(jīng)適當(dāng)?shù)牧呀庾饔煤?，釋放出靶?biāo)蛋白的樣本同樣可以進(jìn)行檢測(cè)，目前我們的產(chǎn)品中也有不少此類靶標(biāo)。再說，細(xì)胞上清樣本。同樣的，需要根據(jù)既往的研究和文獻(xiàn)報(bào)道或者客戶的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確認(rèn)，我們所檢測(cè)的靶標(biāo)是否分泌到上清中，如果無研究和文獻(xiàn)支持，那么檢測(cè)可能無信號(hào)值。也就是不適合使用上清樣本檢測(cè)。
其次，我們使用的血清、血漿、細(xì)胞上清樣本屬于復(fù)雜基質(zhì)的樣本，常常混合了其他與靶標(biāo)蛋白可能發(fā)生結(jié)合的或者多種非特異性物質(zhì)造成的對(duì)檢測(cè)靶標(biāo)蛋白的干擾，也就是基質(zhì)效應(yīng)。那么我們的 ELISA 產(chǎn)品要適應(yīng)這樣的情況，則需要使用適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)體系和測(cè)試體系來解決這樣的問題。這就是我們的檢測(cè)體系從外觀看都一樣，但是實(shí)際成分不一樣的原因。當(dāng)體系不合適時(shí)，可能存在嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)無法消除，從而干擾測(cè)試的準(zhǔn)確性。也就是為何，有的產(chǎn)品只能檢測(cè)血清、血漿，有的產(chǎn)品只能檢測(cè)細(xì)胞上清了。
問題三:為什么要做預(yù)實(shí)驗(yàn)?
答:通過預(yù)實(shí)驗(yàn)可以確定樣本的大致濃度范圍，防止樣本濃度過高或者過低得不到較好的結(jié)果，同時(shí)也可以節(jié)約樣本和試劑盒。
問題四:預(yù)實(shí)驗(yàn)做過標(biāo)曲，正式實(shí)驗(yàn)還需要做標(biāo)曲嗎?
答:需要。原因是避免出現(xiàn)樣本全陰性時(shí)無陽(yáng)性對(duì)照。
問題五:怎么解釋樣本越稀釋濃度值越高?
答:一種原因是樣本受基質(zhì)效應(yīng)的影響。通過剃度稀釋可以消除基質(zhì)的影響，稀釋過后的樣本濃度會(huì)出現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)。
另一種原因是樣本受藥物的影響。
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